韩春雨沉寂3年，再发基因编辑论文
来源：中外学术情报
近期，韩春雨在预印本网站 BioRxiv 发表了一篇关于基因编辑的新论文：
Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE.
该研究开发了一种新型的活细胞 RNA 追踪成像工具 ——VN-dCasE-VC，效果和可用性更强。
该论文署名单位为河北科技大学基因编辑研究中心，通讯作者为韩春雨，第一作者为高峰。
图片来源：BioRxiv 网站截图
前情回顾
2016 年 5 月 2 日，韩春雨（河北科技大学）作为通讯作者在国际顶级学术期刊 Nature Biotechnology 杂志发表了题为：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute（使用 NgAgo 进行 DNA 引导的基因组编辑）的研究论文。
该研究称 NgAgo 对真核生物（包括人）具有基因编辑能力。该研究成功很快在世界范围内爆火，韩春雨老师此前籍籍无名，几乎一夜之间成为学术界网红，被赞誉为「在三流学校取得世界一流原创成果，打破国际基因编辑技术垄断」。
该论文通讯作者为韩春雨，第一作者为高峰，浙江大学教授沈啸为共同通讯作者，但在后续修改版本中，沈啸从作者名单中去除了。
图片来源：Nature 网站截图
2016 年 8 月，河北科技大学成立基因编辑研究中心，计划投入资金逾 2 亿元。但 NgAgo 的研究成果引发广泛质疑。
韩春雨，来源：百度百科
2017 年 8 月 3 日，韩春雨撤回该论文。2018 年 8 月 31 日，河北科技大学取消了韩春雨所获得的荣誉称号，终止了韩春雨团队承担的科研项目并收回了科研经费，收回了韩春雨团队所获校科研绩效奖励。
2019 年 4 月 4 日，预印本网站 BioRxiv 刊登了一篇来自美国普渡大学研究人员的研究论文，表明 NgAgo 通过核酸内切酶活性介导增强大肠杆菌的同源重组。
韩春雨最新论文的解读
CasE 是 Ⅰ-E 型 CRISPR 复合物的核心成分，它通过结合特定的茎环区域单独处理 pre-crRNA，称之为 CasE Binding S，简称为 CBS。CasE 保守 His20 参与催化活性，ΔHis26-TtCse3 突变的 CasE（dCasE）则失去了催化活性，但仍然与其靶标紧密结合。
在该研究中，通过将 split 荧光与 dCasE 的 N 端和 C - 末端（ΔHis20）融合，构建了活体 RNA 跟踪工具 VN-dCasE-VC。该系统仅在存在靶 RNA 时才发出荧光，从而增强信噪比。
在活细胞中进行可视化的 RNA 追踪，不需要特定的亚细胞分布。CasE-GFP 和 dCasE-GFP 在 HEK293T 细胞中的高水平表达和均匀分布表明 CasE 和 dCasE 适合于活细胞中的 RNA 操作。
图片来源：论文配图
为了测试 CasE 在哺乳动物细胞中表达时是否具有强活性，作者构建了「关闭」报告基因质粒 CBS-GFP-N1。它由 5'-UTR 中的 GFP mRNA 和 CasE 结合位点（CBS）组成。当 CasE 被引入系统时，GFP 表达水平急剧下降。
为了进一步测试 CasE 活性，作者还构建了「开启」报告基因质粒 RED-16×CBS-Lin28-C1，其中 CBS 插入 RED 单体基因的 3'-UTR 区和 Lin28 的上游。Lin28 是 RNA 核保留信号，在其 3'-UTR 中具有 lin28 信号的 RED 单体 mRNA 几乎不能翻译成蛋白质。
CBS-CasE 依赖限制性切断 lin28 信号并从核释放靶 mRNA 用于翻译（图 1E 和图 1F）。这些表明 CasE 可以结合并切割哺乳动物细胞中的 CBS。
图片来源：论文配图
为了将 dCasE-CBS 相互作用设计到 RNA 追踪系统中，作者通过将 split-FP5-7 与 dCasE 蛋白结合。发现一个版本，即 VN-dCasE-VC 很难发出荧光，这可能是由于不正确的折叠或不稳定的状态，但是当与靶 RNA（CBS）结合时，可以在荧光显微镜下清楚地捕获荧光信号，即使 VN-dCasE-VC 表达质粒的转染剂量非常低。
这个示意图画的，真是一言难尽...
接下来作者使用 VN-dCasE-VC 系统追踪哺乳动物细胞中过表达的 β- 肌动蛋白（β-Actin）的 mRNA，VN-dCasE-VC 系统在细胞质中显示出强荧光。此外还观察到，向靶 mRNA 添加更多 CBS 可改善信号，荧光追踪更清晰，因此，可以通过增加 CBS 的数量来检测低丰度的 mRNA。
图片来源：论文配图
总的来说，韩春雨团队发明了一种新的 RNA 追踪工具，将其命名为 VN-dCasE-VC。该系统能够追踪活细胞中没有背景的特定 RNA，通过荧光将其可视化。
目前已有两种活细胞 RNA 追踪成像工具，一种是 MS2，一种是 Cas13a，韩春雨团队开发的 dCasE 系统，成像效果由于 MS2，而且，dCasE 蛋白的分子量为 22kDa，远小于 Cas13a 的 130kDa，dCasE 的小分子量更容易递送至细胞内，因此更适合用于活细胞的 RNA 追踪。
需要特别说明的是，该研究目前发表于预印本网站，尚未经过同行评议。
论文链接：
https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2019/05/13/635912.full.pdf
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